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ELISA实验不会失利的经验总结
点击次数:51 发布时间:2018-08-08

在ELISA试剂盒操作过程中总是会呈现或大或小的问题,比如说花板、假阳性、全显色、信号值比空白还低等等。今日上海盈公为咱们带来了一些实验经验总结,教您这样操作ELISA试剂盒实验不会失利。
1.有的包被原可能不是蛋白,关于生物素和脂类物质或小分子物质咱们要事前对其改造再加以包被,我把办法简明的列出如下:
2.亲和素生物素:先亲和素先包被载体,参加生物素化的DNA,这种包被办法均匀、结实,已扩展应用于各种抗原物质的定量测定。
3.小分子必需依靠和大的蛋白载体偶联后才干固定在固相载体上。包被原的性质很重要,蛋白浓度,是否降解,这联系到你做出的抗体可不能够 被其辨认,所以保存抗原很重要,我做重组蛋白时,师兄都严格正告我必定要在冰浴下缓慢消融就是这个道理。
4.脂类物质:可将其在有机溶剂中溶解后参加Elisa板孔中,开盖置冰箱过夜或凉风吹干,待酒精蒸发后,让脂质天然干固在固相外表。
5.应留心以下原理:由于蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸附结合的,靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体外表的疏水基团间 的作用,这种物理吸附长短特异性的,受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响,大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团,故更易 吸附到固相载体外表。包被液的挑选,一般挑选ph9.6的碳酸盐缓冲液。但有时由于实验的需求,包被原的特殊性也可能选用中性的缓冲溶液来包。 具体的实验还要有坚固的理论外也要实践,看一下可不能够应用到自己实验当中去。常用的包被液除了刚才提到的pH9.6碳酸盐缓冲液,还有 pH7.2的磷酸盐缓冲液和pH7-8的Tris-HCL缓冲液等等。
6.但选用什么,要根据实验具体来实践。常用封suo剂有:0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉,能够高浓度使 用(5%-10%);还有一些稀有用到的各种动物血清(首要为了排除相似蛋白搅扰)和酪蛋白等等。封suo就是让大量不相关的蛋白质充填这些旷地闲暇, 然后排挤ELISA试剂盒后的过程中搅扰物质的再吸附。封suo:继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。
7.在洗板时会有必定误差,人为因素很大(当然有条件的用洗板机在外),洗的不完全或串了孔,对如斯敏捷的ELISA体系但是不小的影响。由于 聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,为到达别离游离的和结合的酶符号物的意图,铲除残留在板孔中游离的物质,以及非特异性地吸附的干 扰物质,在洗刷时又应把这种非特异性吸附的搅扰物质洗刷下来。洗刷板:能够说在ELISA操作中,洗刷是zui首要的纽带技能。
8.加抗体标本(和二抗):留意该换枪头时换枪头。标本稀释一般可用pbs稀释,也可用封闭液去稀释。如需加二抗,还要留意二抗的工作浓度,太低则上色浅。
9.显色:显色体系又许多,咱们一开始做的时候,要挑选适合的显色体系。留意显色体系酶活性底物的保存HRP结合物加硫柳泵,AP结合物可加 叠氮钠。
10.每次做尽量要把阴阳空三个对照做好,如呈现问题也好分析。
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