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豚鼠 (Guinea Pig)葡萄球菌A蛋白(SPA)ELISA 检测试剂盒说明书

2014-06-09

本试剂仅供研究使用  标本:血清或血浆

ELISA检测试剂盒试验原理:
SPA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知SPA浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将SPA和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中SPA的浓度呈比例关系。

试剂盒内容及其配制
试剂盒成份(2-8℃保存)    96孔配置    48孔配置    配制
96/48人份酶标板    1块板(96T)    半块板(48T)    即用型
塑料膜板盖    1块    半块    即用型
标准品:240pg/ml    1瓶(0.6ml)    1瓶(0.3ml)    按说明书进行稀稀
空白对照    1瓶(1.0ml)    1瓶(0.5ml)    即用型
标准品稀释缓冲液    1瓶(5ml)    1瓶(2.5ml)    即用型
生物素标记的抗SPA抗体    1瓶(6ml)    1瓶(3.0ml)    即用型
亲和链酶素-HRP    1瓶(10ml)    1瓶(5.0ml)    即用型
洗涤缓冲液    1瓶(20ml)    1瓶(10ml)    按说明书进行稀释
底物A    1瓶(6.0ml)    1瓶(3.0ml)    即用型
底物B    1瓶(6.0ml)    1瓶(3.0ml)    即用型
终止液    1瓶(6.0ml)    1瓶(3.0ml)    即用型

自备材料
蒸馏水。
加样器:5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
振荡器及磁力搅拌器等。

安全性
避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体,请尽快用水冲洗。
实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

ELISA检测试剂盒操作注意事项
试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。
实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。
不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器。
使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取OD值。
加入试剂的顺序应一致,以保证所有反应板孔温育的时间一样。
按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

样品收集、处理及保存方法
血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后,1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
保存------如果样品不立即使用,应将其分成小部分-70 ℃保存,避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒,检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

试剂的准备
标准品:标准品的系列稀释应在实验时准备,不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行:
240 pg/ml    (6号标准品)    原倍浓度不用稀释直接加入50ul。
120 pg/ml    (5号标准品)    100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液
60 pg/ml    (4号标准品)    100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液
30 pg/ml    (3号标准品)    100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液
15 pg/ml    (2号标准品)    100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液
7.5 pg/ml    (1号标准品)    100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液
0 pg/ml    (空白对照)    原始浓度不用稀释直接加入50ul。

洗涤缓冲液(50×)的稀释:蒸馏水50倍稀释。

操作步骤
使用前,将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差。
根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。
加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育1小时。
甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟。
甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
每孔加入底物A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃温育10分钟。避免光照。
取出酶标板,迅速加入50ul终止液,加入终止液后应立即测定结果。
在450nm波长处测定各孔的OD值。

建议使用的实验方案
    标准品浓度(pg/ml)    
A    240    240    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品
B    120    120    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品
C    60    60    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品
D    30    30    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品
E    15    15    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品
F    7.5    7.5    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品
G    0    0    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品
H    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品    样品


局限
6号标准品以上的结果为非线性的,根据此标准曲线无法得到的结果。

试剂盒性能
1. 灵敏度:zui小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。
2. 特异性:不与其它细胞因子反应。
3. 重复性:板内、板间变异系数均小于10%。

结 果 判 断 与 分 析
1、仪器值:于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标(Y),相应的SPA标准品浓度为横坐标(X),做得相应的曲线,样品的SPA含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

3、ELISA检测试剂盒检测值范围:0-240pg/ml

4、敏感度: 0.1 pg/ml

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